대사 공학을 위한 CRISPR/Cas9 잠재력을 활용하는 DNA 조립 툴킷

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 858(2023) 이 기사 인용

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CRISPR/Cas9 기반 기술은 미생물 세포를 조작하는 방식에 혁명을 일으키고 있습니다. 균주 설계에서 CRISPR의 주요 장점 중 하나는 마커가 없는 DNA의 염색체 통합을 가능하게 하여 힘들고 종종 비효율적인 마커 복구 절차를 제거한다는 것입니다. 이점에도 불구하고 CRISPR/Cas9 편집 시스템을 조립하는 것은 여전히 ​​간단한 프로세스가 아니므로 사용 및 적용이 어려울 수 있습니다. 이 작업에서 우리는 현재 Cas9 툴킷의 주요 제한 사항 중 일부를 식별하고 CRISPR 기술에 더 쉽게 접근하고 구현할 수 있도록 개선 사항을 설계했습니다. 여기에는 1) Cre 발현 및 표준 대장균 균주를 모두 사용하여 마커 없는 통합 구성과 마커 기반 통합 구성 간에 신속하게 전환하는 시스템, 2) 골든 게이트 기반 교환을 통해 다중 유전자 통합 카세트를 대체 게놈 유전자좌로 리디렉션하는 기능이 포함됩니다. 3) Cas9-헬퍼 플라스미드와 단일 올리고뉴클레오티드 간의 재결합을 통해 가이드 RNA 서열을 조립하는 신속하고 간단한 생체 내 방법. 우리는 이러한 방법론과 확립된 기술을 CRISPR/Cas9를 사용하는 효율적인 대사 공학을 위한 포괄적인 툴킷으로 결합합니다. 개념 증명으로 우리는 야로위아 리폴리티카용 YaliCraft 툴킷을 개발했습니다. 이 툴킷은 147개 플라스미드와 다양한 목적을 가진 7개 모듈의 기본 세트로 구성되어 있습니다. 우리는 툴킷을 사용하여 137개의 프로모터 라이브러리를 생성 및 특성화하고 373.8 mg/L 호모겐티신산을 합성하는 새로운 균주를 구축했습니다.

CRISPR/Cas9 기반 기술의 개발로 빠르고 정확하며 흉터 없는 게놈 변형이 가능해졌으며 이는 미생물 균주 설계 및 생물생산에 대한 큰 잠재력을 보여줍니다. 특히, 효모의 대사 공학은 공학 생물학에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나로서 화학 물질, 연료, 재료, 식품 및 의약품의 지속 가능한 생산을 가능하게 합니다1. 진핵 세포의 대사 잠재력이 크지만 단일 세포 특성과 빠른 성장으로 인해 효모는 대규모로 설계하고 배양하기가 더 쉽습니다.

이 때문에 CRISPR 시스템은 효모용으로 개발되었습니다2,3,4. CRISPR의 가장 중요한 장점 중 하나는 높은 효율성으로 인해 마커 없는 게놈 변형이 가능하다는 것입니다. 전통적인 균주 공학 과정에서 마커 복구라고 알려진 게놈에서 선택 가능한 마커를 제거하는 것이 일반적인 병목 현상입니다5. 빠르게 성장하는 효모 배양이라도 마커 복구에 최소 5일이 소요되는 반면6, 통합 변환 자체에는 2~3일이 소요됩니다. 따라서 지난 몇 년 동안 CRISPR에 의해 촉진된 여러 마커 없는 통합 기술이 개발되었습니다6,7,8,9. 이러한 발전에도 불구하고 현재 많은 대사 공학 프로젝트는 여전히 마커 기반 접근 방식에 의존하고 있으며, 이는 균주 최적화의 성공을 제한하거나 지연시킬 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 Cas9 기반 효모 엔지니어링의 사용을 용이하게 할 수 있는 CRISPR/Cas9 시스템의 3가지 개선 사항을 확인했습니다. (1) 마커와 마커 없는 변형 간의 쉬운 교환 (2) 다른 통합을 목표로 하는 상동성 암의 빠른 교환 위치 및 (3) gRNA를 복제하는 쉬운 방법.

CRISPR 기반 마커 없는 통합 중에 유일한 선택 요소는 Cas9에 의해 유도된 이중 가닥 절단(DSB)입니다. 증식하려면 세포가 이 병변을 복구해야 합니다. 이는 HR(상동성 재조합)을 통해 통합되거나 NHEJ(비상동 말단 결합), 즉 통합 없이 통합되는 주형(공여체)을 사용하여 발생할 수 있습니다. NHEJ 활동은 빵 효모 Saccharomyces cerevisiae를 포함한 대부분의 곰팡이 종에서 관찰됩니다5,10. NHEJ가 우세한 메커니즘인 종에서 HR을 향상시키는 일반적인 전략은 NHEJ 유전자(KU70, KU80, POL4 및 DNL4)11를 삭제하는 것입니다. 이 전략은 HR을 개선하지만 바람직하지 않은 NHEJ 활동12을 완전히 방지하지는 않습니다. 따라서 느린 성장 표현형으로 이어지는 변형이 있는 형질전환체의 분리는 마커 없는 통합 접근법의 일반적인 문제를 나타냅니다. 이는 NHEJ에 의해 생성된 인델 돌연변이가 과성장하여 희귀하고 느리게 성장하는 통합 형질전환체를 가릴 수 있기 때문입니다. 비록 실패한 공학적 노력이 거의 발표되지 않았지만, 야로위아 리폴리티카에서 SDH5 유전자의 파괴와 관련된 한 가지 예가 있습니다. 여러 번의 시도에도 불구하고 이 수정은 CRISPR 기반 마커 없는 전략을 사용하여 분리되지 않은 반면, 영양요구성 마커를 사용하여 성공적인 삭제가 이루어졌습니다. 유사한 관찰은 종종 일부 유전자좌가 다른 유전자좌보다 수정하기 쉽고 일부는 실패로 남아 있는 효모 엔지니어링 작업에서 널리 일반적입니다. 부분적으로는 느린 재배자를 선택하기가 어렵기 때문입니다. 세포 성장에 해로운 영향을 미치는 이러한 돌연변이는 대사 공학에서 흔히 발생합니다. S. cerevisiae에 대한 게놈 차원의 연구에서는 유전자16의 20% 과발현과 비필수 유전자17의 15% 파괴가 세포 성장에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 또한, 세포 생존 능력은 비대립유전자 변형 간의 상위성 상호작용에 의해 부정적인 영향을 받을 수 있습니다18. 따라서 마커 없는 통합을 기반으로 한 엔지니어링 접근 방식에는 영양요구성 마커를 기반으로 한 엄격한 선택이 필요한 경우가 가끔 있지만 예측하기 어려운 경우가 포함될 수 있습니다. 이러한 경우 새 카세트를 재조립해야 하므로 진행이 크게 지연됩니다. 따라서 CRISPR/Cas9 지원 통합 시스템에 대한 원하는 개선은 마커 없는 시도가 실패할 때 마커 기반 통합으로 쉽게 되돌릴 수 있는 방법입니다.